一：基于qPCR和NGS的血浆eccDNA 纯化和KRAS突变检测

2023年8月，丹麦哥本哈根大学联合罗氏测序发表于Cancer Med的《Methods for the purification and detection of single nucleotide KRAS mutations on extrachromosomal circular DNA in human plasma》的一文，分别基于QIAamp试剂盒（固相二氧化硅纯化法）及酚/氯仿纯化和盐沉淀的DNA纯化法处理样本，比较两种方法从血浆中提取纯化eccDNA的效率，以期建立一套有效的方法来纯化完整eccDNA。

通过比较两种方法的总DNA产量、相对lDNA产量和相对质粒产量（与基线对照），作者发现就总产率而言，固相法更优，可作为血浆eccDNA纯化评估基准标准；就相对质粒纯化率而言，酚/氯仿纯化法更优。而与固相法相比，酚/氯仿法经过外切酶处理后，三种质粒产量均明显降低，表明固相纯化过程中质粒的稳定性更高；但酚/氯仿法对加标lDNA片段的产率明显更低。同时，作者开发了基于qPCR引物的SNP检测系统，尝试用于分析eccDNA上致癌KRAS突变，但结果发现在qPCR之前对纯化的DNA进行滚环扩增并不能提高突变等位基因的检测灵敏度。此外，加入dd-引物（3′-端）wt KRAS引物、优化退火温度或相对于G12D突变目标引物的dd-primer用量均未能提高检测效率。

为评估临床样品中eccDNA上可检测到的KRAS突变的存在，作者采用酚/氯仿纯化法处理16例III-IV期PDAC患者和19例健康对照血浆样本。针对KRAS的结果显示，作者在2725个eccDNA中共鉴定出4223个突变，其中1410个与基因有关，仅20个基因在ClinVar中被注释为具临床意义，而其中18个是在PDAC患者中发现的但均被归类为"良性"突变，表明在当前血浆样本中无法检测到包含KRAS基因的eccDNA。

但分析high-confidence eccDNA可见，其数目和长度在肿瘤与健康样本中呈现出了极其显著的区别。

• 作者从健康样本中平均鉴定出36.6（95% CI：20.6–52.6）个high-confidence eccDNA，平均eccDNA bp总和为24,498（95% CI：13,514–35,483）

  
  

• 而PDAC患者则为126.8（95% CI：33.3–220）个eccDNA，平均eccDNA bp总和为157,558（95% CI：29,807–285,309）。

该结果为后续血液eccDNA的临床应用提供了很好的启示，可从上述eccDNA特征来探索其作为肿瘤生物标记物的价值。

表1 在患者血浆中检测到eccDNA

二：血浆中基因特异性小eccDNA是多癌种诊断和监测的理想生物标志物

目前，中国医学科学院联合多家单位开展eccDNA临床研究，并于2023年9月在Clin Transl Med上发表了一项名为《Small extrachromosomal circular DNAs as biomarkers for multi-cancer diagnosis and monitoring》的研究，作者基于纳米孔测序平台的三代测序流程，对从25例癌症（包括前列腺癌、肝细胞癌和结肠直肠癌）和独立验证队列（包括7例癌症血浆和14例健康血浆）中收集的组织和血浆中的全长小eccDNA（99%小于1.2 kb）进行测序。

在组织中，可见癌症组织小eccDNA的片段长度和数量更大，且在Chr3和Chr6的特定位置富集，且其每条染色体上有更多的由两个片段组成的小eccDNA（2f small eccDNA）。通过核苷酸基序分析可见非癌中小eccDNA可能通过微同源介导的末端连接途径生成小eccDNA，但在癌症组织中未发现这种现象。此外，在癌症和非癌组织均发现小eccDNA在初始形成后通过融合进化，线粒体DNA片段不仅可自身形成小eccDNA，还与染色体片段一起形成小eccDNA。而分析源自特定基因的小eccDNA，发现源自PLD1和ATF6的小eccDNA组合具有很高的多重癌症诊断价值。作者还发现结合癌症和非癌症组织的差异小eccDNA，可提高CEA/CA19-9诊断准确率（AUC = 0.68/0.62提高至AUC ≥ 0.80）。

Fig 1 癌组织中小eccDNA基因组功能注释

选取与组织配对的四份结直肠癌和四份肝细胞癌血浆样本进行鉴定，发现与癌症组织不同，癌症血浆中小eccDNA大小更小。在癌症血浆中具有而在非癌症组织中未发现的小eccDNA，如源自MEP1A的eccDNA（Chr6:46 819 468-46 819 807），其在其他8名受试者的血浆样本中同样得到验证，并可在三种癌症血浆中检测到，而在正常血浆中检测不到。进一步发现癌症血浆与配对癌组织之间存在一些共享的小eccDNA，但在配对的非癌症组织中未检测到。随机选择了3个小eccDNA在三种样品中进行验证，发现其具有个体特异性，可作为生物标记物追踪个体化癌症治疗的效果。

Fig 2 癌血浆中小eccDNA的一般特征

在癌症血浆和癌症组织中鉴定得到72个共享的小eccDNA相关基因，包括了一些癌症相关基因，如ALK、ERG、ETV6和CSNK2A3。且这些共享的小eccDNA相关基因的KEGG富集在某些癌症相关途径。在组织和血浆中，作者发现源自这些共享基因的小eccDNA显示较高的多癌诊断价值，尤其是来自ETV6（cut-off point：0.000019）和ALK（cut-off point：0.000022）的小eccDNA组合在组织中显示出了很高的多癌诊断价值。此外，在与癌症组织配对的8份癌症血浆中，其显示出很高的诊断灵敏度（100%）。将组合截断点应用于独立验证队列（7份癌症和14份正常血浆样本），发现其阳性预测值（100%）和阴性预测值（82.35%）较高，表明了其具有作为无创多癌症诊断生物标记物的潜力。同时，通过与这些小eccDNA相结合，CEA/CA19-9多癌症预测准确性可分别提高至AUC> 0.80（组织）和0.95（血浆）。

Fig 3 癌症血浆中小eccDNA基序分析及其对多种癌症的诊断价值

参考文献：

1. Bøllehuus Hansen L, Jakobsen SF, Zole E, et al. Methods for the purification and detection of single nucleotide KRAS mutations on extrachromosomal circular DNA in human plasma. Cancer Med. 2023 Aug 21. 

2. Luo X, Zhang L, Cui J, et al. Small extrachromosomal circular DNAs as biomarkers for multi-cancer diagnosis and monitoring. Clin Transl Med. 2023 Sep;13(9):e1393. 

地址：浙江省杭州市萧山区萧山科技城传化科创大厦A座701-B