单核RNA测序联合空间转录组揭示胰腺癌与新辅助治疗相关的多细胞动力学-行业动态-杭州瀚因生命科技有限公司-瀚因生命

文章背景

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种高度致命且难治性癌症，当前PDAC分子分层仍处于初级研究阶段，尚不能为临床管理或治疗开发提供信息。本研究利用单核RNA测序（snRNA-seq）和全转录组数字空间分析（DSP）技术，分析组成PDAC的细胞亚型和空间群落的分子景观，探索改善胰腺癌新辅助和辅助治疗的潜在治疗靶标。

研究设计：本研究采用43例初级PDAC冷冻标本，包括接受手术切除（n=25）或未接受新辅助治疗（n=18）的患者，并进行snRNA-seq、多重离子束成像（MIBI）及DSP分析。其中部分患者接受了多周期化疗，并进行了多分割放疗及氟尿嘧啶/卡培他滨（CRT；n=14）治疗；另有5名患者参加了一项加用氯沙坦（CRTL）的临床试验。通过构建PDAC细胞图谱，作者发现了PDAC恶性细胞和成纤维细胞的复发性表达程序，揭示了不同细胞群落在疾病进展中的贡献。同时通过优化的分子和细胞分类法，为临床试验中的PDAC分层提供框架。

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图1 PDAC肿瘤精细分子分类

主要结果

1. 人类PDAC肿瘤snRNA-seq

作者确定了33个细胞亚群，在样本中发现明显癌症相关成纤维细胞（CAF）分布，此外，发现snRNA-seq捕获的免疫细胞比例分布与MIBI评估结果有所差异。与未治疗组相比，CRT/CRTL临床亚组的肿瘤恶性细胞比例显著降低。

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图2 人类PDAC肿瘤snRNA-seq

2.腺泡-导管化生（ADM）和非典型导管细胞

在上皮区室内，发现存在低拷贝数变异（CNA）核共表达导管和腺泡谱系的标志物，可能反映为ADM。ADM细胞的HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP标记表达更高。导管细胞的一个独特亚群具高水平导管和恶性标记物，但CNA未升高，故称之为非典型导管细胞，其具有在PanIN2/3期就表达的基因，并且比ADM细胞具有更高水平KRAS，提示从ADM进展到前体病变。轨迹分析证实了从腺泡到ADM到导管到非典型导管到恶性细胞的转化路径，与KRAS特征增加趋势一致，表明了ADM和非典型导管细胞为PDAC发生的中间状态。

图3 上皮细胞类型组成及分化状态推断

3.PDAC恶性细胞分子分层

作者确定了14个恶性细胞程序，包括谱系：经典（CLS）、鳞状（SQM）、基底样（BSL）、间充质（MES）、腺泡样（ACN）、神经内分泌样（NEN）和NRP，或细胞状态（cycling-S，cycling-G2/M，MYC、干扰素、肿瘤坏死因子/核因子κB（TNF-NFκB），核糖体和粘附），以及4个CAF程序：肌成纤维细胞祖细胞（MYO）、嗜神经性（NRT）、免疫调节（IMM）、粘附（ADH-F）。

与前人定义的恶性特征进行比较，发现CLS重叠度较高，而SQM和BSL与Moffitt basal特征显著重叠，但SQM和MES分别与前人定义的鳞状和类间充质亚型无显著重叠，并进一步在真正的高CNA恶性细胞中鉴定出了ACN和NEN。

同时，作者富集了独特的NRP程序，分离了既往在其他恶性肿瘤的研究中难以区分的NRP和NEN。NRP包含了部分人类蛋白质图谱中的“Brain-enhanced”基因，并通过多重免疫荧光原位进行验证，发现了在大脑皮层和尾状神经元和神经胶质细胞中表达的程序基因——NRXN3。NRP特征或与轴突引导、肿瘤-神经串扰和PDAC中神经周围侵袭高患病率相关基因中的体细胞畸变相关。

图4 PDAC中恶性细胞的分子分层

在CAF程序中，MYO与已发表的myCAF特征重叠，但可通过富集参与胚胎中胚层发育和Wnt信号传导的基因进行区分；NRT、IMM和ADH-F均与单细胞iCAF特征重叠，但不与myCAF特征重叠，表明它们可能反映了不同的iCAF子集。IMM程序在细胞因子产生/反应、炎症和TNF-α/NF-κB信号传导的途径中富集。ADH-F特征是涉及细胞-细胞/细胞-细胞外基质粘附、细胞骨架重塑和运动的途径。嗜神经程则序富集参与神经发生、神经元分化和神经元投射的基因。

图5 PDAC中CAF的分子分层

4.与治疗相关的恶性肿瘤和CAF程序的表达

在患者水平上，新辅助治疗与恶性和CAF程序表达的显著差异相关。CRT组恶性NRP和NEN明显高于未治疗组，而CLS和SQM较低。与未治疗相比，新辅助CRTL组也表现出更高表达的NRP和低表达的CLS、SQM和BSL。同时，在体外患者源性类器官系中，NRP在CRT治疗后增加。相对于未治疗，CRT/CRTL显示出低MYO和高ADH-F表达；IMM在CRT中高于CRTL组。此外，治疗后的程序表达也与临床反应相关，发现与未治疗肿瘤相比，具有至少最小反应的患者的残留恶性细胞在NRP中富集，在CLS和SQM中则耗竭。作者还评估了恶性和CAF程序的预后相关性，发现NRP和SQM与较短的进展时间（TTP）相关，而CLS和IMM与较长的TTP相关。

图6 肿瘤恶性程序与不良临床结果相关

5.将细胞类型和程序映射到肿瘤结构中

作者在石蜡包埋切片上捕获和分析具不同模式的肿瘤细胞、CAF和免疫细胞的感兴趣区域（ROI），并将恶性和CAF程序表达映射到ROI上。发现除了MES、IMM和MYO外，大多数程序在患者肿瘤之间的表达变化大于来自同一肿瘤（患者内）的不同ROI。而与未治疗样本相比，CRT组中NRP和NEN富集。

图7 恶性和CAF程序的空间映射

6.揭示特殊多细胞群落

作者确定了3个具不同恶性、基质和免疫特征的多细胞群落：Community 1特征为NRP和NEN、NRT和CD8 T细胞之间的关联；Community 2特点是SQM和BSL与多种淋巴细胞和髓细胞类型、较高的上皮细胞和免疫细胞含量，以及较低的CAF含量相关联。Community 3表现出CLS、MYO和ADH-F、巨噬细胞、中性粒细胞和经典2型树突状细胞（cDC2）之间的关联，以及较高的CAF和较低的免疫比例。

此外，发现与Community 1一致，高NRP和/或NEN评分的ROI显著富集CD8 T细胞，经典1型树突状细胞（cDC1）则耗竭。高评分的SQM、BSL或MES ROI的CD8 T细胞减少。SQM与B细胞相关；除cDC2外的所有DC亚群与BSL和MES相关。具有高CLS评分的ROI富含CD4 T细胞。NRT与CD8、CD4和调节性T细胞呈正相关，与活化的DC（aDC）和cDC1呈负相关；MYO和ADH-F分别仅与巨噬细胞和cDC2呈正相关；IMM与aDC、cDC1、浆细胞样DC和浆细胞呈正相关，与CD4 T细胞和巨噬细胞呈负相关。因此，空间关联既包括聚类分析中反映的广泛的多细胞群落，也包括与特定细胞类型和程序对相关的更精细的特征。

最后，作者发现在未治疗和CRT标本中，一些受体-配体对的相关性良好，但许多受体-配体对的相关性因治疗状态而异。在治疗样本中富集的细胞间受体-配体相互作用子集可能促进治疗耐药，并可作为干预的候选靶点。

图8 恶性、CAF程序和免疫细胞组成的空间分析

参考文献：Hwang WL, Jagadeesh KA, Guo JA, et, al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nat Genet. 2022 Aug; 54(8):1178-1191

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