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文章背景

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研究设计

我们采用了来自26名患者的29个肺部样本的204157个细胞，涵盖了正常肺样本、早期LUAD样本和晚期LUAD样本，系统地探索了不同阶段LUAD患者的TME和ITH。以免疫细胞为重点，通过scRNA-seq和Bulk RNA-seq建立了LUAD单细胞转录图谱以及针对不同肺部疾病样本细胞和分子特征的单细胞网络，探讨了LUAD不同阶段免疫细胞谱系的细胞多样性和分子复杂性，并构建了恶性和免疫细胞的细胞代谢和细胞间相互作用。

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主要结果

1.正常肺、早期LUAD和晚期LUAD组织的单细胞转录组学分析

检测到9种cell type，分别是：B cells，T cells，myeloid cells，fibroblasts cells，endothelial cells，mast cells，epithelial cells，cancer cells，和alveolar cells。其中cancer cluster的拷贝数变异（CNV）明显高于normal cells和alveolar cluster，而normal cells和alveolar cluster的CNV相似。

图1：正常肺组织、早期LUAD和晚期LUAD的单细胞图谱

2. 构建正常肺组织和不同病变LUAD的单细胞网络

（1）为了表征从正常肺组织到晚期LUAD的单细胞转录组，细胞比例分析发现在非恶性样本中myeloid cells显著增加，在晚期LUAD中fibroblasts显著增加，而T cells在不同肺样本中的比例相似。通过检测差异基因的表达，发现与先天免疫反应、抗炎和预后不良相关的基因主要集中在晚期LUAD；而与抗炎相关的基因主要集中在早期LUAD；与炎症和正常肺泡功能相关的基因主要集中在正常肺样本。此外，相比于早期LUAD，晚期LUAD中大多数细胞具有更高的转录噪声，尤其是B cells和alveolar cells，晚期LUAD可能具有较高水平的异质性。

图2：正常肺组织和不同LUAD中细胞类型及单细胞转录组分析

（2）建立单细胞转录组网络，发现正常肺组织、早期LUAD和晚期LUAD中每个细胞群间存在很强的联系。同时，发现不同病变的LUAD具有不同的代谢模式，表明TME中细胞类型的代谢模式可能会影响免疫细胞的抗肿瘤机制。

图3：非恶性肺、早期LUAD和晚期LUAD的单细胞转录组网络

3.不同病变的恶性细胞差异和肿瘤克隆异质性

通过分析9名患者的68089个肿瘤来源细胞，发现21861个恶性细胞形成患者特异性簇，患者间存在显著异质性。分析肿瘤细胞特异性转录多样性评分及GSVA分析发现，晚期LUAD多样性得分高于早期LUAD（p=0.023）；相比于早期恶性细胞，晚期恶性细胞中大部分通路上调，且在晚期LUAD患者中，与活性氧、炎症和血管生成相关的通路也会上调。且不同患者富集通路不同，如患者25富集KRAS_SIGNALING_DN、WNT_BETA_CATENIN_SIGNALING和ESTRO-GEN_RESPONSE_EARLY；患者23富集REACTIVE_OXIGEN_SPECIES_PATHWAY、INTER-FERON_ALPHA_RESPONSE和ANGIOGENESIS。不同病变的LUAD存在肿瘤间和肿瘤内的转录异质性，且晚期LUAD患者的ITH水平高于早期LUAD患者。

图4：早期LUAD和晚期LUAD中恶性细胞scRNA谱系分析

4.不同病变的LUAD中免疫细胞的单细胞表达谱和免疫谱系

（1）免疫细胞是TME的重要组成部分，重新类聚T cells、B cells和myeloid cells，建立免疫细胞的单细胞表达谱，其中T cells聚类为CD8+/CTL T cells，CD4+Tcells，regulatory T cells和natural killer cells；B cells聚类为follicular B cells，MALT B cells，和plasma B cells；myeloid cells聚类为macrophages，granulocytes，Langerhanscells，和monocyte-derived dendritic cells。分析细胞比例发现，CD8+/CTL T cells，regulatory T cells，和macrophages在晚期LUAD中显著增加；，而follicularb cells，Langerhanscells和CD4+ T cells的频率显著降低，且macrophages的比例随着疾病的进展逐渐增加。此外，MHC II分子在早期LUAD频率降低的细胞中过度表达，特别是在macrophages中，而晚期LUAD中的macrophages具有显著较低的MHC II基因表达，这些结果表明macrophages在LUAD的发展中起着至关重要的作用。

图5：正常肺、早期LUAD和晚期LUAD中免疫细胞的单细胞scRNA谱

（2）鉴于macrophages的作用，重新类聚了macrophages，共聚类了17个cluster，将其中具有来自单一状态细胞（同一样本来源细胞比例≥60%）的8个cluster定义为“domain” cluster，表明macrophages中存在普遍异质性。此外，分析了macrophages与疾病进展之间的关系，M2样的和抗炎型的macrophages在晚期LUAD中被证实，并发现与不良预后相关的炎症通路主要富集在晚期LUAD domain cluster中，表明晚期LUAD中的macrophages具有抗炎表型，并能促进LUAD生长。

图6：正常肺、早期LUAD和晚期LUAD中macrophages的scRNA 谱

（3）进一步明确免疫细胞在肺癌中的作用，Bhattacharyya分析发现早期和晚期LUAD之间CD8+/CTL T细胞（p<0.001），follicular B cells（p<0.001）和regulatory T cells（p<0.001）存在显著差异。基因调控分析显示，INTERFERON_GAMMA_RESPONSE，KRAS_SIGNALING_DN，和SPERMATOGENESIS通路在晚期follicular B cells中富集。分化路径显示，从非特异性的natural killer cells分别向CD8+/CTL T cells、CD4+ T cells和regulatory T cells分化，CD4+ T cells为中间状态，而CD8+ /CTL和regulatory T cells主要在晚期LUAD组中，表明早期和晚期LUAD之间T cells复杂的重编程。

图7：免疫细胞的基因调控分析和分化路径

（4）差异表达分析发现，相比于早期LUAD，CXCL13在晚期CD8+/CTL T cells和regulatoryT cells高表达，可以作为晚期LUAD患者的一个预后指标和治疗靶点。SCENIC分析6597个CD8+/CTL和2396个regulatory T cells，发现晚期CD8+/CTL T cells转录因子BHLHE40和KLF6具有更高活性，且与INFLAMMATORY_RESPONSE，APICAL_JUNCTION，KRAS_SIGNALING_DN通路关联密切；晚期regulatory T cells中转录因子YBX1和CHD2具有更高活性，且KRAS_SIGNALING_DN，INTER-FERON_ALPHA_RESPONSE，COMPLEMENT通路过度上调，在晚期LUAD中KRAS信号可能是潜在的治疗靶标。

图8：T cells的转录因子和通路分析

5.细胞间的相互作用

通过CellTalker分析，分别在正常肺组织、早期LUAD组织和晚期LUAD组织中确定了4种，20种和50种独特的相互作用。与早期LUAD相比，GNAI2-DRD2，GNAI2-LHCGR，和C4B-CD46间的相互作用仅出现在晚期LUAD中；COL3A1-MAG，FN1-MAG，HLA-C-SLC9C2，和COL2A1-MAG间的相互作用仅出现在早期LUAD中，相比于正常肺和早期LUAD样本，晚期LUAD细胞间通讯环境更独特。

图9：正常肺部样本、早期LUAD和晚期LUAD中细胞间配-受体的相互作用

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研究结论

本文利用单细胞测序构建了不同状态下肺样本的单细胞图谱，揭示了晚期恶性肿瘤细胞的TME更复杂，具更高水平的ITH；与其它免疫细胞相比，在早期和晚期LUAD细胞中，CD8+/CTL T细胞，regulatory T cells和follicular B cells之间的差异更显著；细胞和细胞之间的交流分析表明早期和晚期LUAD分别具有20和50种相互作用，可能是晚期LUAD独特特征的来源；晚期LUAD中CXCL13和KRAS信号传导可能是潜在的治疗靶标。本项研究得出的成果为阐明LUAD的发生机制提供了宝贵的理论基础，同时也极大促进了LUAD的靶向治疗的发展。