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eccDNA

时间:2021-08-04   访问量:19

eccDNA(环状DNA)测序

概述

eccDNAextrachromosomal circular DNA)即染色体外环状DNA,广泛存在于包括人类在内的真核生物细胞中,它们通常是从正常基因组中分离或脱落下来,游离于染色体基因组之外的环状DNA分子。对酵母、线虫、纤毛虫和哺乳动物的eccDNA进行全基因组序列分析后发现,eccDNA的大小从几十个碱基到几十万个碱基对不等,不仅携带完整或部分基因,而且还携带基因间序列,且部分包含复制起始点,能独立完成复制。相比于游离的线性DNAeccDNA不易被核酸酶降解,结构上更加稳定。

1965年首次在哺乳动物和高等植物中发现了eccDNA分子至今,人们发现eccDNA大量存在于肿瘤细胞中,且常携带原癌基因,可通过增加癌基因的表达来促进肿瘤的发生。2019NatureCell发表的两篇关于癌症中的eccDNA的文章还表明:eccDNA具有显著的染色体开放状态和更远距离相互作用的形式,其非编码区的增强子功能也可在eccDNA所携带的癌基因表达调控中发挥功能,进一步将eccDNA的表观特征与癌症联系起来。此外,eccDNA还与耐药、衰老、肿瘤异质性、细胞间交流等功能相关。

 

形成机理

目前研究表明,eccDNA是从染色体上断裂、环化或者额外复制产生的序列,其剪切加工机理主要提出有两种可能:

1)通过染色体异位同源重组环化(intrachromatid ectopic homologous recombinationHR);

2)通过非同源染色体末端连接环化(nonhomologous end-joiningNHEJ)。eccDNA形成是一个复杂的过程,更多环化方式有待探索。

技术流程

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技术应用

l  疾病机理研究:通过准确地识别eccDNA随后基因注释,快速找到癌症、肿瘤等疾病机理研究和诊断的靶向eccDNA

l  药物相关研究:药物作用机制、新药研发、耐药性及敏感性研究。例如2014Paul S. Mischel团队发现胶质瘤细胞中存在携带EGFR VIII突变型基因的eccDNA,介导了EGFR抑制剂耐药

l  潜在标志物预测:临床生物标志物发现、生物标志物功能研究,推动eccDNA在液体活检以及生物标志物方面的应用

 

技术优势

一站式服务:

客户只需提供细胞、组织或基因组DNA,瀚因生命为您完成eccDNA富集,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。

eccDNA检出率高:

采用多种方法高 效地富集eccDNAeccDNA检出率高。

专业的生物信息学分析:

专业的生物信息学团队,开发了高效识别分析eccDNA的算法,且含有市面上已有eccDNA鉴定方法。提供eccDNA的染色体信息、坐标信息、长度信息、反式剪切位点信息、序列信息、对应的基因信息、基因的GO条目及KEGG信号通路注释信息等,满足客户的各类深入数据分析需求。

 

送样要求

样品类型:

细胞、组织、基因组DNA。其它类型样品请致电详询我司。

样品量:

a)       细胞 2×107

b)       组织 100mg

c)       DNA:每个样品总量不少于10ug,溶于无菌水或 TEPH = 8)(OD 260/280值应在1.72.0 之间;RNA 应该去除干净;不得有其它个体或其它物种的DNA污染)。

样品运输及保存:

样品运输:样品置于1.5mL Eppendorf管中,封口膜封好,干冰运输,DNA可用冰袋运输。

样品保存:细胞样品或新鲜组织块切块,液氮冻存后-80℃保存;DNA样品短期内可-20℃,避免反复冻融。

 

测序方案

l  测序模式:PE150

l  测序数据量:6-10 GB

 

参考案例

案例一:Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissueNature Communication2018IF=11.878

本文针对8名定期锻炼和8名久坐不动的男子进行骨骼肌样本和血液样本的收集,通过裂解细胞、过柱纯化的方法获取eccDNA,并滚环扩增和建库测序。通过分析测序数据大约鉴定出约10万个不同的eccDNA,其中绝大部分长度小于25kb,主要分布在0.1-5KB之间。从肌肉中检测到的eccDNA中,43960个是高度可信的。在白细胞中,6253eccDNA是高度可信的,且运动组和静坐组之间的eccDNA并没有差异。另外通过eccDNA在基因组上的分布情况探索eccDNA具体来源于哪些染色体的哪些位置,并联合RNAseq数据分析发现eccDNA形成的基因偏好性。

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1-1 eccDNA的长度分布

 

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1-2 eccDNA在基因组上的分布情况

案例二:Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expressionNature2019IF=43.07

该文利用集成成像、远距离光学匹配、表观生物学技术和高通量测序,首次正面解析了癌基因所在的ecDNA的结构和基本功能。通过整合肿瘤细胞系和TCGA临床肿瘤样本的RNA-seqWGS数据,证明了高度表达的癌症基因是由ecDNA编码的;利用ChIP-seq技术和免疫荧光技术,分析活跃癌细胞中促进型组蛋白修饰H3K4me1H3K27ac和抑制型组蛋白修饰H3K9me3H3K27me3的发生情况,发现ecDNA上存在较多活跃型组蛋白修饰和少量抑制型组蛋白修饰;利用ATAC-seqMNase-seq证明ecDNA的染色质是高度开放的,且比核染色体上DNA开放性更高;采用解析染色质的空间结构的 PLAC-seqHi-ChIP)技术发现ecDNA可以形成3D功能结构域,说明ecDNA能在空间上产生远距离调控。

 image.png

2-1 eccDNA上高表达的癌症基因

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2-2 eccDNAH3K4me1H3K27ac的分布

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2-3  eccDNA开放程度较核染色体高

image.png

2-4 eccDNA环状图谱使远端DNA相互作用成为可能

 

 

参考案例

eccDNA生物信息分析

 

标准生信分析

1)        数据基本处理与质控

Sample

数据产量(Gb)

Q30(%)

TotalRawReads

MappedReads

MappedRate%

Duplicate%

Sample1

7.958

80.96

29389945

77788186

94.35

68.9

Sample2

8.976

83.37

90522674

85387197

94.33

25.66

Sample3

7.537

81.91

73127934

67698065

92.57

26.59

Sample4

8.552

81.48

84573950

77005651

91.05

24.26

根据测序得到的数据进行质控等基本处理,得到各个样本的质控结果如上表所示。包含样本总read数,map到参考基因组上的数量以及mapping比率等。

2)        eccDNA整体统计

image.png          image.png          image.png

计算出各个样本检测到的eccDNA数量后,查看各样本鉴定的eccDNA overlap情况。查看eccDNA长度分布情况(中间图,横坐标为length(bp),纵坐标为count)和分布频率(上图最右),还可以查看各染色体上eccDNA分布情况。

3)        样本组间比较

image.png                     image.png

比较正常组和癌症组直接的eccDNA数量情况,其中epm表示eccDNA per million mappable reads。比较两组间片段大小。

4)        eccDNA功能预测


 image.png                                 image.png

image.png                                  image.png

将得到的eccDNA位点信息进行注释后,分析各个样本中eccDNA的富集信息,包括GOKEGG等。

高级生信分析

5)        预测marker

eccDNA优于线性DNA的生物稳定性以及独特的分子结构特征,为迅速发展的无创活检道路增添了新的方向,如果有较多的临床样本,它非常适合做生物标志物的研究。利用机器学习对已有数据进行训练模型,寻找biomarker,建立统计模型预测患者未来患病严重性等。

 

更多定制化信息分析…

可结合客户的需求,协商确定更多定制化信息分析内容。


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