单细胞转录组学技术平台
技术原理
细胞是生物体最小的功能单位。每一个细胞独一无二的基因表达特征与细胞及组织的功能息息相关。传统的基因测序在组织样本或细胞群的整体上进行，细胞之间的差异可能因平均化被掩盖。单细胞测序技术可在单细胞层面揭示出每个细胞独特的基因信息及基因表达特征，使不同的细胞类型得以精细区分，同时可以对不同类型细胞间的相互关系做更深、更系统的研究和了解。这一工具极大的帮助了人们理解生命现象、研究发病机制、发现诊断生物标志物及治疗靶点，为科研人员及临床专家提供了新的纬度和视角。
1. 每个Chromium解决方案都从高度多样化的凝胶珠（Gel Beads)开始，每个凝胶珠都带有独特的寡核苷酸条形码序列，以及便于捕获目标分子的功能化序列。
2. 在Chromium 系统内，将带有条形码的凝胶珠与细胞或细胞核、酶以及分液油混合，产生成千上万个单细胞乳液微滴，这些微滴被称为“GEM”（Gel Bead-inemulsion).
3. 每个GEM都作为单独的反应囊泡，凝胶珠在其中溶解，捕获每个细胞的目标分子，添加条形码并扩增。
4. 扩增后，来自同一细胞的所有片段都共享一个10x条形码。将成千上万个细胞的带有条形码的产物混合，进行下游反应，从而产生与短读长测序仪兼容的文库。
5. 在测序后，全方位的生物信息学工具将利用可识别的条形码序列将测序片段定位到原本的单细胞或细胞核。
技术流程
技术应用
l 构建大规模细胞图谱
l 鉴定和发现稀有细胞亚型
l 可探究肿瘤的异质性、微环境、耐药机制
l 干细胞发育及分化
技术优势
l 不需要微量扩增，降低假阳性率；
l 真正的单细胞水平测序，Doublet rate：0.9%/1 000个细胞；
l 灵活的获取量，可一次性对100～80 000个细胞建库，提高效率；
l 广泛的研究应用领域，超短的项目周期。
送样要求
l 样本物质：人源样本
l 细胞数量：>50000
l 细胞浓度：1000个/μL
l 细胞尺径：5μm – 40μm
l 细胞活性：>80%
参考案例
1. 肿瘤异质性：脑胶质瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等。
研究人员通过单细胞转录组测序分析的方法，在移植瘤或正常人心脏中活性血管生成期间，研究小鼠内皮细胞及其他基质细胞的异质性。他们将肿瘤内皮细胞分为三个亚群，还对其他肿瘤基质细胞进行了表型分类，发现肿瘤相关成纤维细胞（TAF）通过上调缺氧相关基因并产生与血管生成有关的分泌因子来对抗血管生成药物治疗作出反应。总体而言，此研究更好地定义了肿瘤内皮细胞和其他基质细胞的异质性，揭示了VEGF和Dll4-Notch在指定肿瘤内皮表型中的作用，突出了基质细胞对抗血管生成治疗的反应。（Cancer Res; 78(9); 2370–82.）
心脏中的细胞群和内皮细胞亚群
2. 胚胎发育：胚胎干细胞分化、植入前胚胎筛查。
皮层中间神经元的多种亚群在高阶脑功能中起着至关重要的作用。为研究如何产生这种多样性，研究人员选择单细胞RNA测序来描绘沿着发育时间收集到的小鼠细胞的转录表达情况。通过整合不同发育时间点的数据集，确定了成人中间神经元及其前体之间转录组异质性的共同来源，并揭示了主要中间神经元亚型的胚胎发生。（Nature. 2018 Mar 22; 555(7697): 457-462.）
3. 细胞图谱
心脏纤维素的形成，对于理解心脏发育和正常器官功能以及制定对抗心脏病的治疗策略必不可少。研究人员使用单细胞RNA测序对小鼠非心肌细胞的单细胞转录谱进行了全面的分析，揭示了心脏纤维素的多样性及广泛的细胞间通讯网络。研究重塑了作者对心脏细胞组成的理解，并强调了非心肌细胞类型的重要作用。（Cell Rep. 2018 Jan 16; 22(3): 600-610.）
单细胞转录组学生物信息分析
标准数据分析流程：
标准分析内容：
1. 单细胞数据基本处理
2. 质控
3. PCA主成分降维
5. 差异基因的表达
6. 细胞类型注释
7. 细胞差异基因功能富集分析
8. 基因调控网络状态分析（高级分析）
9. 细胞分化轨迹分析（高级分析）
10. 细胞特异转录因子鉴定（高级分析）
11. 细胞互作分析（高级分析）
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