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单细胞ATAC-seq

时间:2021-07-30   访问量:7

单细胞ATAC

技术原理

在解决细胞异质性的同时,研究表观遗传学调控机制,同时结合motif分析来识别参与基因表达调控的转录因子,是单细胞表观遗传学的重要突破。

 

10x Genomics Chromium Single Cell ATAC Solution(10x scATAC-seq)是在单细胞表观基因组学水平上揭示染色质可接近性的研究策略。通过单细胞染色质可接近性图谱构建,不仅能清晰了解染色质结构,还可以绘制高分辨率转录因子调控网络,为深入了解疾病的诊断和治疗铺平道路。

 

 

单细胞ATAC-Seq(scATAC)基于转座酶介导的测序引物插入开放的染色质区域。像普通的ATAC-Seq一样,该测定法提供了染色质开放和可及区域的轮廓,这些轮廓指示了单细胞分辨率下的活跃调控区域。

 

我们的scATAC-Seq服务可以同时检测数千个细胞的全基因组染色质可及性,从而可以检测异种群体中的细胞亚群,这种细胞亚群的信息会在普通ATAC-Seq中丢失。

 

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技术流程

转座酶处理:使用改造Tn5转座酶,捕获染色质开放区,将测序接头引入染色质开放区的两端。

细胞核标记:将Tn5转座酶处理后的样本加入10x芯片,利用barcode标记细胞来源,形成油滴包裹的GEM。

文库构建:基于Tn5转座酶引入的测序接头构建文库。

 

 

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技术应用

单细胞测序技术绘制人类造血细胞分化调控图谱

通过对10类已定义的人类造血细胞亚群进行单细胞ATAC测序及数据分析,构建造血过程相关细胞的染色体可接近性图谱,描绘造血分化轨迹。

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细胞类型与人类疾病的相关性:

根据单细胞的染色质可及性的异同将所有细胞分为不同的亚群,并对亚群进行注释,得到小鼠的染色质可及性图谱;在此基础上,研究染色质可及性的组织特异性,以内皮细胞为例,发现内皮细胞可分为9个亚类,不同组织中的亚类组成有较大差异。最后将单细胞ATAC-seq与GWAS(全基因组关联分析)结合起来,揭示了细胞类型与人类疾病的相关性

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揭示组织空间构架

不同层级神经元的染色质可及性区域表现出了一定的差异,因此推测染色质可及性变化与组织空间架构有关。

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源于表观遗传变异的细胞异质性研究

PD-1阻断免疫疗法前后采集的基底细胞癌患者的原发性肿瘤活检样本进行了检测,通过分析37,818个细胞的ATAC-seq数据,发现来源于不同患者的基质细胞、免疫细胞基本聚到一起,而肿瘤细胞的分群则表现出明显的异质性。


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PD-1阻断免疫疗法后,对治疗有反应的患者中呈现出两种T细胞亚群(TEx细胞和Tfh细胞)的扩张,且比例相当,暗示这两种细胞类型在PD-1阻断后,其分化过程可能处于一致的调控模式(Nat. Biotechnol., 2019, 37: 925-936)

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基因表达上游基因调控网络的构建

为了让转录因子1(TF1)调控特定细胞中的TF2,该细胞中的TF1基因必须具有活性,且TF2基因上的TF1结合位点必须可以接近。如下图建立基因调控网络。TF2的转录需要TF1(蓝色)的表达,且TF2上的TF1结合位点可以接近。(改编自Hupé et al., 2012 (CC BY 3.0))

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通过scATAC-seq数据,研究人员可以根据开放染色质上顺式调控元件的基因活性评分来推断特定细胞中转录因子的表达。推定的转录因子结合位点的可接近性可作为转录因子表达数据的补充,以建立细胞类型特异性的调控网络。斯坦福大学的研究人员在上文提到的混合表型急性白血病研究中,利用这种方法及其scATAC-seq数据,将启动子可接近性与靶基因表达相关联,从而确定了调控白血病基因的疾病特异性网络。重要的是,各个细胞谱系和发育状态的转录因子活性以及更广泛的调控网络都可以追踪,而这在单独使用scRNA-seq时颇具挑战性。

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 定义新的细胞类型

与单细胞RNA-seq一样,单细胞ATAC-seq也可以对相似的细胞类型和状态进行鉴定和聚类。不过,scATAC-seq数据所用的细胞类型注释方法略有不同。使用scATAC-seq进行细胞注释的最简单的方法是将开放启动子区域作为转录活性的信号。

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 细胞发育及分化研究

10x Genomics的科学家对近20,000个骨髓单核细胞和CD34+分选细胞开展了scATAC-seq。推断从干细胞到B细胞、单核细胞和红系细胞的发育轨迹。有了发育轨迹可帮您实现更进一步的研究,确定不同分化状态下变化并可能决定分化状态的转录因子基序和增强子。

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 肿瘤等疾病的生物标志物研究

血小板中检测到癌细胞特异的RNA标志物

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技术优势

低成本:每个细胞成本远远低于传统单细胞测序、组织测序;

短周期:1h即可完成Tn5转座酶对染色质开放区域的切割;

高通量:7min即可完成1,000-80,000个细胞核的标记;

大数据:可获得多至万个细胞的数据,不依赖于抗体捕获,全面性研究染色质开放区域;

专业软件:配套官方可视化软件。

 

送样要求

样本物质:人源样本

细胞数量:>50000

细胞悬液浓度:600-1200个/µl

细胞尺径:5μm- 40 μm

细胞活性:>80%

 

 

 

 

 

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利用ATAC-seq技术分析染色质开放区域已在活体中发现驱动肿瘤发育的转录因子及调控区域。然后对找到的染色质活性开放区域进行转录因子预测分析,发现了两个关键的转录因子,猜测它们可能与染色质图谱的变化有关。

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利用ATAC-seq,发现NFI家族转录因子富集在具有差异的染色质开放位点中,预示着NFI家族转录因子在调控肿瘤细胞转移中扮演着重要角色。

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小鼠单细胞ATAC-seq数据与人类GWAS数据关联分析,揭示细胞类型与人类疾病之间的关系。

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瀚因生命10x Genomics单细胞ATAC-seq测序标准信息分析内容主要包括

 

测序数据质量评估
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测序序列的比对
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染色质可接近性区域鉴定
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细胞鉴定
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细胞分群
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转录因子差异分析


数据质控

 

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在本批测试样本中,预期目标细胞数为8500个,经过细胞核计数及上样体系估算,最终获得了8658个有效细胞核的数据,且细胞及背景间能明确区分。每个细胞检测到的fragments中位数为30508,比对到目标区域(转录起始位点、DNase超敏感位点、增强子和启动子区域)的片段比率为82.5%(55%为合格),有效peaks片段占比为71.2%(25%为合格)。Q30方面,都达到了85%以上。

 

细胞聚类

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利用peaks及对应的基因,分析获得细胞聚类结果,在测试数据中,基于染色质可接近程度,可将样本细胞分为13个亚群

 

转录因子motif富集分析

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转录因子结合在特定的motif上,利用10x Genomics单细胞ATAC-seq数据,可对peaks中的motif进行富集分析,同时可使用10x Genomics官方的可视化软件Loupe Cell Browser查看。

 

 

 


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